اولین گزارش از Diplodia malorum Fuckel عامل بیماری شانکر درختان سیب در ایران

در تابستان سال 1388 بیماری خشکیدگی شاخه و شانکر تنه درختان سیب (Malus domestica Borkh.) رقم گلدن در باغات استان آذربایجان غربی دیده شد. بیماری در اثر تنش‌های محیطی مثل خشک‌سالی و سرمازدگی گسترش یافته، پوست و سیستم آوندی درخت در محل آلودگی کاملا تیره می‌شود و محل شانکر در تنه اصلی و شاخه‌ها پوسته پوسته می‌گردد. جهت جداسازی، بافت‌های آلوده و مشکوک به بیماری به مدت 3 دقیقه در اتانول 70 درصد ضد‌‌عفونی سطحی گردیده و 3 مرتبه با آب مقطر سترون شسته شدند. قطعات پس از خشک شدن بین کاغذ صافی سترون، روی محیط کشت PDA منتقل و در دمای 25 درجه سلسیوس و تاریکی قرار داده شدند. از قارچ‌های رشد کرده در حاشیه بافت‌های گیاهی، قطعاتی برداشته شده و به محیط کشت آب آگار 2 درصد منتقل و عمل خالص‌سازی به روش کشت نوک ریسه انجام گرفت. برای القای تشکیل اندام‌های باردهی غیر جنسی، از روش سوزن کاج قرار گرفته روی محیط کشت آب آگار 2 درصد استفاده گردید. تشتک‌های مایه‌زنی شده به مدت 4 هفته در دمای 25 درجه سلسیوس و در زیر نور نزدیک ماورا بنفش (near-UV) و با دوره نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی جهت تولید پیکنیدیوم‌ها نگهداری شدند (Pavlic et al. 2008). برای شناسایی قارچ‌های رشد یافته، معیارهای مختلف ماکروسکوپی از قبیل رنگ و خصوصیات ظاهری رشدی پرگنه و مشخصات میکروسکوپی از قبیل رنگ، شکل و ابعاد کنیدیوم، سلول‌های کنیدی‌زا و پیکنیدیوم مورد مطالعه قرار گرفتند. برای تأیید شناسایی مورفولوژیک، بخش ITS در یکی از جدایه‌های منتخب، با استفاده از آغازگر‌های ITS1 و NL-4 تکثیر و ترادف‌یابی گردید. بر اساس مطالعات مورفولوژیک و ترادف یابی بخش ITS ، گونه Diplodia malorum شناسایی شد. مشخصات توصیفی گونه به شرح زیر است: بافت پرگنه در ابتدا سفید رنگ، ولی بعد از گذشت دو هفته به رنگ زیتونی نخودی تا زیتونی متمایل به سبز تغییر یافته و در نهایت بعد از سه هفته کاملاً سیاه می‌شود. کنیدیوماتاها به صورت پیکنیدیومی، به قطر تقریبی 600 × 500 میکرومتر، به طور منفرد یا در دسته‌های چندتایی به شکل گرد تا تقریباً مخروطی، به رنگ قهوه‌ای تیره تا سیاه و فرورفته در بافت و در هنگام بلوغ کمی شکوفا می‌باشند. سلول‌های کنیدی‌زا بی‌رنگ، صاف، استوانه‌ای شکل، در قسمت پایه متورم و به ابعاد 16- 7 × 5- 5/2 میکرومتر هستند. کنیدی‌زایی در یک سطح با قطور شدگی حاشیه‌ای (Priclinal) و یا به‌صورت percurrent و دارای 2 یا 3 حلقه می‌باشد. کنیدی‌ها با دیواره ضخیم، با سطح بیرونی صاف و سطح درونی زگیل‌دار، تقریباً بیضی کشیده تا استوانه‌ای، در هر دو انتها گرد، ابتدا بی‌رنگ و یک سلولی بوده و به مدت طولانی در داخل پیکنیدیوم بی‌رنگ باقی می‌مانند ولی بعد از خروج از پیکنیدیوم، به رنگ قهوه‌ای تیره تغییر می‌یابند و دارای یک دیواره عرضی (ندرتا 2 دیواره عرضی) و به ابعاد 16-11 × 34-5/19 میکرومتر می‌باشند (شکل 1). جستجوی بلاست توالی به‌دست آمده با توالی‌های موجود در بانک ژن شباهت 100 درصدی آن را با جدایه‌های گونه Diplodia malorum تأیید نمود (Phillips et al. 2012). آزمون اثبات بیماری‌زایی، با تلقیح جدایه‌ها روی نهال‌های دو ساله و هم‌چنین میوه سیب رقم گلدن در قالب طرح کاملاً تصادفی به همراه تیمار شاهد انجام گرفت. بعد از گذشت 8 هفته، تمام نهال‌های تلقیح شده توسط جدایه‌های قارچی علائم شانکر، سیاه و خشک شدن پوست در اطراف محل تلقیح شده را نشان دادند، در صورتی‌که در تیمار شاهد، هیچ‌گونه سیاه‌شدگی و یا خشک‌شدن پوست مشاهده نگردید و بافت کالوز در اطراف زخم ناشی از برداشتن حلقه تشکیل و رشد عادی نهال‌ها ادامه یافت. در مورد میوه‌ها، مطالعات بیماری‌زایی نشان داد که بعد از گذشت 6 روز، در اطراف محل تلقیح، علایم پوسیدگی قهوه‌ای تیره با حاشیه کاملاً مشخص و متمایز از بافت سالم ایجاد شد و در برش عمودی از محل تلقیح، پیشرفت پوسیدگی به داخل میوه به‌طور مشخصی مشاهده گردید، در صورتی‌که در تیمار شاهد هیچ‌گونه علائم پوسیدگی یا تغییر رنگ ایجاد نگردید (شکل 2). از بافت‌های تازه آلوده شده و دارای نشانه‌های سیاه شدگی پوست در نهال‌ها و میوه‌ها، بعد از عمل ضد عفونی سطحی، عمل جداسازی و شناسایی قارچ مجددا انجام گرفت و به این ترتیب اصول کخ اثبات شد. نتایج تجزیه واریانس آزمون اثبات بیماری‌زایی نشان داد که تمام جدایه‌های مورد مطالعه، روی نهال‌ها و میوه‌های سیب بیماری‌زا بوده و نسبت به تیمار شاهد تفاوت معنی‌داری نشان دادند. بر اساس بررسی منابع، این اولین گزارش از وجود و تعیین بیماری‌زایی گونه Diplodia malorum مرتبط با شانکر درختان سیب در ایران می‌باشد.